Проинсулин по химической структуре

Впервые инсулин был выделен в 1922 г. Бантингом (Banting) и Бестом (Best) из поджелудочной железы больных тяжелым диабетом. Это открытие означало возвращение их к практически нормальной жизни здорового человека. На бытовом уровне слово «инсулин» ассоциируется с термином «сахар крови», что довольно справедливо, т.к. инсулин влияет на метаболизм углеводов, хотя сопутствующие нарушению его продукции изменения обмена липидов, приводящие к ацидозу и атеросклерозу, могут быть первопричиной смерти больных диабетом.

Наряду с этим у больных с длительно существующим диабетом существенно снижена способность синтезировать белки, что приводит к изнашиванию тканей и функциональным нарушениям в клетках. Очевидно, что инсулин влияет на обмен белков и жиров не в меньшей степени, чем на обмен углеводов.

Если несколькими словами характеризовать инсулин, это будет определение, в котором слово «инсулин» ассоциировалось бы с понятием «энергетическое изобилие». Очевидно, что если предлагается богатая энергией пища, особенно с избытком углеводов, то инсулин начинает продуцироваться в большом количестве. Таким образом, инсулин играет важную роль в запасании энергии.

Если в организм поступают избыточные количества углеводов, они запасаются в виде гликогена в печени и мышцах; если избыток углеводов уже не может депонироваться в виде гликогена, то под влиянием инсулина он превращается в жиры и депонируется в жировой ткани. Применительно к белкам инсулин оказывает непосредственнее влияние на захват аминокислот клетками и синтез из них белка. Кроме того, инсулин тормозит распад белков, уже находящихся в клетках.

Синтез инсулина

Инсулин человека представляет собой молекулу белка с молекулярной массой 5808. Он состоит из двух аминокислотных цепочек, соединенных между собой дисульфидными связями. Если эти связи разрушить, разъединив таким образом цепочки аминокислот, инсулин утратит свою активность.

Инсулин синтезируется в бета-клетках островков Лангерганса обычным механизмом синтеза белка. Трансляция инсулина начинается на рибосомах, связанных с эндоплазматическим ретикулумом, с образования препрогормона инсулина. Этот исходный препрогормон с молекулярной массой 11500 в эндоплазматическом ретикулуме расщепляется до проинсулина с молекулярной массой около 9000. Далее в аппарате Гольджи большая его часть дробится на инсулин, упаковывающийся в секреторные гранулы, и пептидный фрагмент. Однако почти 1/6 часть конечного секретируемого продукта остается в форме проинсулина. Проинсулин является неактивной формой гормона.

В крови инсулин циркулирует в несвязанной форме, время его полувыведения составляет всего около 6 мин, поэтому плазма практически полностью освобождается от инсулина за 10-15 мин. Оставшаяся несвязанной с рецепторами клеток-мишеней часть инсулина разрушается главным образом в печени ферментом инсулиназой; в меньшей степени разрушение инсулина происходит в почках и мышцах; совсем небольшая часть — в других тканях. Такое быстрое очищение плазмы от инсулина очень важно, т.к. иногда быстрое прекращение регуляторных влияний инсулина не менее существенно, чем их включение.

ПРОИНСУЛИН — биосинтетический предшественник (прогормон) инсулина, синтезирующийся в бета-клетках панкреатических островков — insulae pancreaticae (островков Лангерганса).

В 1969 г. Стайнер (D. F. Steiner) выделил прогормон инсулина (см.) и назвал его проинсулином. Изучение хим. природы П. показало, что он является полипептидом, состоящим из 80—82 аминокислотных остатков, с мол. весом (массой) ок. 10 000. Молекула П. представляет собой молекулу инсулина, COOH-конец В-цепи к-рой соединен с NH₂-концом А-цепи через дипептиды аргиниларгинин и аргиниллизин, принадлежащие так наз. С-пептиду (рис.).

Число аминокислотных остатков в С-пептидах проинсулинов животных разных видов и человека варьирует от 27 до 32. С-пептиды проинсулинов быка, крысы, свиньи и человека различаются значительно больше, чем молекулы соответствующих инсулинов. Так, если инсулины быка и свиньи отличаются друг от друга только по 3 аминокислотным остаткам, то С-пептиды проинсулинов этих же видов — по 11 аминокислотным остаткам. Однако концевые аминокислоты всех С-пептидов независимо от вида одинаковы и являются местом приложения действия протеолитических ферментов, поэтому механизм превращения П. в инсулин под действием протеаз всегда одинаков и не зависит от видовых различий в молекулах П. С-пептид играет важную роль в формировании конформации молекулы П., необходимой для образования молекулы инсулина. Появление свободного С-пептида в крови позволяет в какой-то мере судить об интенсивности превращения П. в инсулин и соответственно — о функциональном состоянии островкового аппарата поджелудочной железы (см.).

Местом синтеза П. являются микросомы бета-клеток панкреатических островков. Сборка молекулы П. происходит в эндоплазматической сети. С рибосом транслируется молекула препроинсулина, содержащая на 14—20 аминокислотных остатков больше, чем молекула П. Это — так наз. сигнальный пептид, который обеспечивает перенос П. через микросомную мембрану рибосомно-мембранного комплекса во внутриклеточное пространство. Там сигнальный пептид отщепляется, и молеку ла П. переходит в аппарат Гольджи (пластинчатый комплекс), от к-рого отделяются секреторные гранулы, содержащие П. и ферменты, участвующие в превращении П. в инсулин (см. Гольджи комплекс).

Превращение П. в инсулин происходит в несколько стадий при участии эндо- и экзопептидаз (см. Пептид-гидролазы). В результате ограниченного протеолиза образуется промежуточная форма П., где С-пептид отделен только с NH₂-конца А-цепи инсулина, это — интермедиат-I, затем С-пептид отделяется от COOH-конца В-цепи инсулина. При определенных условиях С-пептид может отделиться только в этой точке, и тогда в крови появляется так наз. интермедиат-II, который представляет собой молекулу инсулина, соединенную с С-пептидом через NH₂-конец А-цепи инсулина. Интермедиаты I и II обладают разной биол. активностью. Полноценная молекула инсулина образуется после протеолитического отщепления С-пептида и соединительных дипептидов, которые могут быть гидролизованы до свободных аминокислот — аргинина и лизина. Нарушение процессов превращения П. в инсулин может привести к изменению соотношения между П., его промежуточными формами и инсулином, выходу П. и его промежуточных форм в кровь и, соответственно, нарушениям в обмене веществ.

Биол. активность П. изучена недостаточно. Известно, что П. и его промежуточные формы в отношении утилизации глюкозы менее активны, чем инсулин. Отмечено низкое сродство П. к рецепторам, специфически связывающим инсулин. Обнаружено, что П. реагирует с антителами к инсулину. С-пептид также обладает хорошо выраженными иммунными свойствами, что используется при приготовлении радиоиммунологических наборов для определения количества C-пептида в сыворотке крови.

Для определения П. применяют хроматографию (см.) на ДЭ-целлюлозе и более информативный — ферментативный метод с использованием инсулинспецифической протеазы. Этот фермент расщепляет молекулу инсулина за определенное время, но не действует в течение этого же времени на молекулу П., после чего П. может быть определен радиоиммунологическими методами.

При ряде патол. состояний секреция II. и количество его в крови могут изменяться по сравнению с нормой (5—10% от содержания в крови инсулина). Клин, картина в этих случаях зависит от того, какая промежуточная форма П. поступила в кровь. Секреция промежуточных форм П. может привести к гипогликемии (см.), т. к. интермедиаты I и II обладают определенной инсулиноподобной биол, активностью. При секреции в кровь непревращенного П. содержание глюкозы в крови может значительно повышаться (см. Гипергликемия).

Содержание П. в крови повышено при некоторых видах инсулом (см.), у больных сахарным диабетом (см. Диабет сахарный) на определенных стадиях заболевания, при панкреатитах (см. Панкреатит) в тех случаях, когда воспалительный процесс захватывает и эндокринную ткань поджелудочной железы.

В качестве лекарственного средства П. не применяют.

Библиография: Биохимия гормонов и гормональной регуляции, под ред. Н. А. Юдае-ва, с. 93, М., 1976; Cuatrecasas Р. Membrane receptors and hormone action, Advanc. Protein Chem., v. 30, p. 251, 1976; Staroseltzeva L. K. ‘Enzymic transformation of proinsulin, Ergebn. exp. Med., v. 28, p. 63, 1978; Steiner D. F. Proinsulin and the biosynthesis of insulin, New Engl. J. Med., v. 280, p. 1106, 1969.

Инсулин, получивший свое название от наименования панкреатических островков (лат. insula – островок), был первым белком, первичная структура которого была раскрыта в 1954 г. Ф. Сэнджером (см. главу 1). В чистом виде инсулин был получен в 1922 г. после его обнаружения в экстрактах панкреатических островков Ф. Бантингом и Ч. Бестом. Молекула инсулина, содержащая 51 аминокислотный остаток, состоит из двух полипептидных цепей, соединенных между собой в двух точках дисульфидными мостиками. Строение инсулина и его предшественника проинсулина приведено в главе 1 (см. рис. 1.14). В настоящее время принято обозначать цепью А инсулина 21-членный пептид и цепью В – пептид, содержащий 30 остатков аминокислот. Во многих лабораториях осуществлен, кроме того, химический синтез инсулина. Наиболее близким по своей структуре к инсулину человека является инсулин свиньи, у которого в цепи В вместо треонина в положении 30 содержится аланин.

Существенных различий в аминокислотной последовательности в инсулине от разных животных нет. Инсулины различаются аминокислотным составом цепи А в положениях 8–10.

Согласно современным представлениям, биосинтез инсулина осуществляется в β-клетках панкреатических островков из своего предшественника проинсулина, впервые выделенного Д. Стайнером в 1966 г. В настоящее время не только выяснена первичная структура проинсулина, но и осуществлен его химический синтез (см. рис. 1.14). Проинсулин представлен одной полипептидной цепью, содержащей 84 аминокислотных остатка; он лишен биологической, т.е. гормональной, активности. Местом синтеза проинсули-на считается фракция микросом β-клеток панкреатических островков; превращение неактивного проинсулина в активный инсулин (наиболее существенная часть синтеза) происходит при перемещении проинсулина от рибосом к секреторным гранулам путем частичного протеолиза (отщепление с С-конца полипептидной цепи пептида, содержащего 33 аминокислотных остатка и получившего наименование соединяющего пептида, или С-пепти-да). Длина и первичная структура С-пептида подвержена большим изменениям у разных видов животных, чем последовательность цепей А и В инсулина. Установлено, что исходным предшественником инсулина является препроинсулин, содержащий, помимо проинсулина, его так называемую лидерную, или сигнальную, последовательность на N-конце, состоящую из 23 остатков аминокислот; при образовании молекулы проинсулина этот сигнальный пептид отщепляется специальной пептидазой. Далее молекула проинсулина также подвергается частичному протеолизу, и под действием трипсиноподобной протеиназы отщепляются по две основные аминокислоты с N- и С-конца пептида С – соответственно дипептиды Aрг–Aрг и Лиз– –Aрг (см. рис. 1.14). Однако природа ферментов и тонкие механизмы этого важного биологического процесса – образование активной молекулы инсулина окончательно не выяснены.

Синтезированный из проинсулина инсулин может существовать в нескольких формах, различающихся по биологическим, иммунологическим и физико-химическим свойствам. Различают две формы инсулина: 1) свободную, вступающую во взаимодействие с антителами, полученными к кристаллическому инсулину, и стимулирующую усвоение глюкозы мышечной и жировой тканями; 2) связанную, не реагирующую с антителами и активную только в отношении жировой ткани. В настоящее время доказано существование связанной формы инсулина и установлена локализация ее в белковых фракциях сыворотки крови, в частности в области трансферринов и α-глобулинов. Молекулярная масса связанного инсулина от 60000 до 100000. Различают, кроме того, так называемую форму А инсулина, отличающуюся от двух предыдущих рядом физико-химических и биологических свойств, занимающую промежуточное положение и появляющуюся в ответ на быструю, срочную потребность организма в инсулине.

В физиологической регуляции синтеза инсулина доминирующую роль играет концентрация глюкозы в крови. Так, повышение содержания глюкозы в крови вызывает увеличение секреции инсулина в панкреатических островках, а снижение ее содержания, наоборот,– замедление секреции инсулина. Этот феномен контроля по типу обратной связи рассматривается как один из важнейших механизмов регуляции содержания глюкозы в крови. На секрецию инсулина оказывают влияние, кроме того, электролиты (особенно ионы кальция), аминокислоты, глюкагон и секретин. Приводятся доказательства роли циклазной системы в секреции инсулина. Предполагают, что глюкоза действует в качестве сигнала для активирования аденилат-циклазы, а образовавшийся в этой системе цАМФ – в качестве сигнала для секреции инсулина.

При недостаточной секреции (точнее, недостаточном синтезе) инсулина развивается специфическое заболевание – сахарный диабет (см. главу 10). Помимо клинически выявляемых симптомов (полиурия, полидипсия и полифагия), сахарный диабет характеризуется рядом специфических нарушений процессов обмена. Так, у больных развиваются гипергликемия (увеличение уровня глюкозы в крови) и гликозурия (выделение глюкозы с мочой, в которой в норме она отсутствует). К расстройствам обмена относят также усиленный распад гликогена в печени и мышцах, замедление биосинтеза белков и жиров, снижение скорости окисления глюкозы в тканях, развитие отрицательного азотистого баланса, увеличение содержания холестерина и других липидов в крови. При диабете усиливаются мобилизация жиров из депо, синтез углеводов из аминокислот (глюконеогенез) и избыточный синтез кетоновых тел (кетонурия). После введения больным инсулина все перечисленные нарушения, как правило, исчезают, однако действие гормона ограничено во времени, поэтому необходимо вводить его постоянно. Клинические симптомы и метаболические нарушения при сахарном диабете могут быть объяснены не только отсутствием синтеза инсулина. Получены доказательства, что при второй форме сахарного диабета, так называемой инсулинрезистентной, имеют место и молекулярные дефекты: в частности, нарушение структуры инсулина или нарушение ферментативного превращения проинсулина в инсулин. В основе развития этой формы диабета часто лежит потеря рецепторами клеток-мишеней способности соединяться с молекулой инсулина, синтез которого нарушен, или синтез мутантного рецептора (см. далее).

У экспериментальных животных введение инсулина вызывает гипогликемию (снижение уровня глюкозы в крови), увеличение запасов гликогена в мышцах, усиление анаболических процессов, повышение скорости утилизации глюкозы в тканях. Кроме того, инсулин оказывает опосредованное влияние на водный и минеральный обмен.

Механизм действия инсулина окончательно не расшифрован, несмотря на огромное количество фактических данных, свидетельствующих о существовании тесной и прямой зависимости между инсулином и процессами обмена веществ в организме. В соответствии с «унитарной» теорией все эффекты инсулина вызваны его влиянием на обмен глюкозы через фермент гексокиназу. Новые экспериментальные данные свидетельствуют, что усиление и стимуляция инсулином таких процессов, как транспорт ионов и аминокислот, трансляция и синтез белка, экспрессия генов и др., являются независимыми. Это послужило основанием для предположения о множественных механизмах действия инсулина.

Рис. 8.1. Инсулиновый рецептор (схема). Две α-цепи на наружной поверхности мембраны клетки и две трансмембранные β-цепи. Связывание инсулина с α-цепями запускает аутофосфорилирование остатков тирозина в β-цепях; активный тирозинкиназный домен затем участвует в фосфорилировании неактивных белков-мишеней в цитозоле.

Наиболее вероятной в настоящее время представляется мембранная локализация первичного действия почти всех белковых гормонов, включая инсулин. Получены доказательства существования специфического рецептора инсулина на внешней плазматической мембране почти всех клеток организма, а также образования инсулинрецепторного комплекса. Рецептор синтезируется в виде предшественника – полипептида (1382 аминокислотных остатка, мол. масса 190000), который далее расщепляется на α-и β-субъединицы, т.е. на гетеродимер (в формуле α₂–β₂), связанные дисульфидными связями. Оказалось, что если α-субъединицы (мол. масса 135000) почти целиком располагаются на внешней стороне биомембраны, выполняя функцию связывания инсулина клетки, то β-субъединицы (мол. масса 95000) представляют собой трансмембранный белок, выполняющий функцию преобразования сигнала (рис. 8.1). Концентрация рецепторов инсулина на поверхности достигает 20000 на клетку, и период их полужизни составляет 7–12 ч.

Самым интересным свойством рецептора инсулина, отличным от всех других рецепторов гормонов белковой и пептидной природы, является его способность аутофосфорилирования, т.е. когда рецептор наделен сам протеинкиназной (тирозинкиназной) активностью. При связывании инсулина с α-цепями рецептора происходит активирование тирозинкиназной активности β-цепей путем фосфорилирования их тирозиновых остатков. В свою очередь активная тирозинкиназа β-цепей запускает каскад фосфо-рилирования–дефосфорилирования протеинкиназ, в частности мембранных или цитозольных серин- или треонинкиназ, т.е. протеинкиназ и белков-мишеней, фосфорилирование в которых осуществляется за счет ОН-групп серина и треонина. Соответственно имеют место изменения клеточной активности, в частности активация и ингибирование ферментов, транспорт глюкозы, синтез полимерных молекул нуклеиновых кислот и белков и т.д . Следует подчеркнуть, однако, что тонкие молекулярные механизмы путей передачи сигнала от инсулинрецепторного комплекса на множество внутриклеточных процессов пока не раскрыты. Вполне возможно участие в подобных процессах ряда внутриклеточных вторичных мессенджеров, в частности циклических нуклеотидов, производных фосфатидилинозитолов и др. Нельзя исключить, кроме того, возможности существования внутриклеточного посредника или медиатора действия инсулина (особого внутриклеточного рецептора), контролирующего транскрипцию генов и соответственно синтез мРНК. Предполагают, что действием инсулина и участием в регуляции экспрессии генов или в транскрипции специфических мРНК может быть объяснена его роль в таких фундаментальных процессах жизнедеятельности, как эмбриогенез и дифференцировка клеток высших организмов.